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文献赏析

一定发视角:新的乙肝病毒一定发亚型可预测中期肝癌的预后

2019/08/02

        乙肝在我国有非常庞大的患者群体,而乙肝患者如果长期得不到缓解,出现肝硬化的表现,最终可能向肝癌发展。而针对乙肝发病的元凶——乙型肝炎病毒(HBV)的一定发还远远不够。乙型肝炎病毒X.一定发(HBx)是HBV一定发组的四个开放阅读框之一,可编码17kDa的APP质,科学家已经发现HBx的变异与肝一定发癌(HCC)进展密切相关。然而,目前基于全长HBx序列的一定发型和一定发型分类一定发,还不能做到使用HBV一定发对HCC的进展进行预判。一定发edf合作伙伴-东方肝胆外科医院周伟平教授团队,采用了测序技术成功发现了HBx新的突变一定发型HBx-E2,证实了该突变可作为HCC诊断的新biomarker。通过人类APP质组官网技术进一步发现了HBx-WT可结合宿主APPJAK1, 而HBx-E2不能结合JAK1APP,进而HBx-E2不能够通过激活JAK1-STAT通路进一步促进HCC的发生,使得HBx-E2一定发型HCC病人获得更好的预后。该一定发不仅发现了新的HCC预后诊断标志物一定发,并对该一定发调控预后的详细机理进行了阐述,相关成果近期发表在国际顶级学术期刊《Journal of Hepatology》(PMID: 30654066)上。

 

一定发视角解读⇩⇩⇩

1. 发现集:组织样品中发现HBx变异与HCC进展相关和预后相关
        乙型肝炎病毒X一定发(HBx)的遗传变异经常发生,临床上观察到该变异与肝一定发癌(HCC)进展密切相关。然而,目前基于全长HBx序列的一定发型和一定发型分类仍然不能预测HBV对HCC进展的影响。

        为了改善这一现状,作者先使用primarycohort(发现集,组织样本,n=284)对HBx DNA进行测序和聚类分析,将全长HBx一定发的一定发型进行分类。在发现集队列中,通过对肿瘤和非肿瘤组织样品中的HBx DNA中的变体一定发座的聚类分析鉴定了三种HBx一定发型:HBx-EHBH1,HBx-EHBH2和HBx-EHBH3(图1)。红色表示突变,蓝色表示无突变。

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图1 HBx DNA中变体一定发座聚类分析 

 

        进一步通过生存率曲线分析,发现携带HBx-EHBH2(HBx-E2)一定发型HCC患者的无复发生存期(RFS)和总生存期(OS)更好(图2)。


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图2 发现集HBx-E2一定发型的生存率更好


2. 验证集:血清+组织样品验证HBx-E2一定发型HCC预后更佳

        作者后续利用validation cohort(验证集,组织,n=171;血清,n=168)对训练集结果进行检测验证。通过对组织样本分析发现:HBx-E2一定发型在BCLC B(巴塞罗那分期,B期)的预后诊断效果更显著,同时,HBx-E2一定发型携带者预示着更高的生存率(图3)。

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图3 HBx-E2较适用于BCLC B期


        由于血清样品相较于组织更容易收集获取,更利于检测标志物,一定发人员进一步检测血清中的HBx-E2一定发型,发现HBx-E2携带者的无复发生存期(RFS)和总生存期(OS)也更好。而且同样在BCLC B期患者中p<0.05,这对TACE(肝动脉化疗栓塞术:BCLC B期患者建议治疗方法)治疗后患者的预后评估有非常重要的意义(图4)。

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图4 血清一定发型生存率差异


3. 一定发动物层面验证不同一定发型功能

        为了证明HBx的各个一定发型功能,作者用HBx-WT序列的相应位点替换为HBx-E2一定发型变体的非同义一定发座,获得HBx-E2-非同义(HBx-E2-N)序列。通过用HBx-E2的变体位点的同义一定发座取代HBx-WT序列的相应碱基,获得HBx-E2-同义(HBx-E2-S)序列,进行了后续的一系列实验。

        一定发和动物实验的结果均显示HBx-E2和与其同义的HBx-E2-N在体外和体内丧失了促进HCC增殖,一定发周期和凋亡的能力,但具体它是通过什么途径介导的尚不明确(图5)。


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图5 不通一定发型在动物一定发层面的影响


4. 通过人类APP质组官网找到HBx-WT与HBx-E2的差异互作APP

        为找到阐明HBx-E2和与其同义的HBx-E2-N一定发型丧失促进HCC增殖,一定发周期和凋亡能力的原因,作者对HBx-WT和HBx-E2这两种APP的直接结合APP进行探索,寻找它们各自特有的互作APP。首先体外重组表达了这两种一定发型APP,并与一定发edf合作,采用Huprot 20K人类APP质组官网(覆盖2万种人类全长APP)技术,快速找到了42种APP质可与HBx-E2和HBx-WT相互作用。其中,有16种APP质只与HBx-WT一定发型相互作用。16种结合APP中的三种(JAK1,RBBP4,CAP2)与HCC的发生与发展相关。而JAK1作为将一定发因子信号转导至STAT的分子,在一定发增殖中起关键作用。因此,作者后续选择了JAK1进行验证,通过进行CO-IP加WB、免疫荧光共定位等实验证明了HBx-WTAPP与JAK1之间确实存在物理相互作用。(图6)


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图6 互作APP筛选及验证


5. JAK-STAT信号通路调控机理

        HBx-WT已经通过人APP质组官网及相关实验证明可与JAK1相互作用,那么它是否会影响其活性等进而影响整个JAK-STAT通路呢?

        WB和IHC显示JAK1、STAT3、STAT5的磷酸化水平活性在HBx-E2和HBx-E2-N中明显下降(图7),可见HBx-E2对JAK-STAT通路激活能力明显下降,而JAK / STAT信号通路与一定发的增殖,一定发周期,凋亡和分化密切相关。


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图7 WB及IHC等验证JAK-STAT通路


        所以作者最终提出机制假说:HBx-WT变异为HBx-E2后,其表达的APP失去与JAK1相互作用,进而失去了激活JAK1 / STAT通路的能力,最终导致一定发增殖受阻(机制原理见图8)。


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图8 机制原理图


小结

        综上所述,在本一定发中,作者通过测序发现了新的HBx突变一定发型,并构建对应的同义和非同义序列,证明其功能,最终利用人类APP组官网技术快速找到了相较于突变体HBx-E2,HBx-WT特有的多个直接结合APP,快速锁定到与HCC密切相关的JAK-STAT通路上游分子JAK1APP。这对于后续解释HBx-WT一定发变异导致肿瘤进展受阻机理至关重要,大大缩短了实验周期,为机制解释指明了方向。

        纵观全文,作者的思路非常清晰,从发现集中发现新的一定发型,进一步分析发现其对中期HCC具有预后评估意义,验证集加入血清样品重视临床可行性,更难得的是进一步进行功能及机制一定发,阐明了HBx-E2一定发型携带者具有更好预后的原因。该一定发思路清晰,实验设计严谨,技术路线经典(图9),值得一定发视角推荐。


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图9 全文技术路线图


        在机制探索方面,作者利用一定发edf推出的人类APP组官网技术,筛选互作APP,几周内快速锁定了JAK1APP,效率之高远超传统技术。人类APP组官网在筛选互作APP一定发中具有如下特征性优势
1. 官网实验为体外实验,官网上每个APP点相互独立,保证筛选到的互作APP均为目标APP的直接结合APP,数据分析简单。

2. 体内环境复杂,很多APP结合现象稍纵即逝,并且APP表达存在空间和时间上的差异,利用体外环境条件下的筛选,可以很快发现很多潜在结合靶标,结合每个APP的edf学功能再进行后续实验验证的实验策略更加高效,数据也更加全面。

3. 在不同组织、一定发、一定发器中,APP的表达丰度差异很大,传统的CO-IP等实验很难发现低丰度APP的互作现象,人类APP组官网上的APP是酵母纯化表达的APP,可以保证每种APP的丰度,官网实验容易发现潜在APP互作现象。

4. 利用人类APP组官网实验筛选互作APP,从APP质层面分析互作数据,避免了CO-IP后质谱鉴定时,从多肽水平跨层分析互作APP的不确定性和复杂性。

5. 相比酵母双杂交实验,APP官网实验周期短、假阳性率低,方便复杂实验设计,可以设计多种实验对照,更能确保互作APP数据的准确性。

 

英文文献链接:https://www.journal-of-hepatology.eu/article/S0168-8278(19)30018-2/pdf

 

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