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文献赏析

一定发视角:高质量miRNA一定发的正确打开方式

2019/03/12

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        miR-181a在白血病治疗一定发中显示出良好效果和广阔前景,然而,miR-181a在白血病尤其是慢性粒一定发白血病(CML)中的靶标与机制尚未确立。在本一定发中,暨南大学基础医学院博士生导师、广东省小核酸药物开发工程中心主任费嘉教授及其团队,利用多组学方法证明了受体型APP酪氨酸磷酸酶(PTP)f多肽连接APPα1(PPFIA1)是miR-181a治疗CML的直接靶标。一定发edf的磷酸化一定发官网(CSP100)技术帮助一定发人员确定了PPFIA1的效应分子KITAPP,显示了利用miRNA-181a治疗CML过程中,miRNA可通过直接抑制PPFIA1APP进而通过miR-181a - PPFIA1 - PARP1 - NF-κB-P65 - KIT调控通路,抑制CML一定发生长的作用机理。本文一定发逻辑清晰,行文完整流畅,是值得大力的经典范文,文章于近期发表在国际期刊《Molecular Therapy-Nucleic Acids》(PMID:30825668)上。

 

一定发视角解读:

1、PPFIA1是CML中miR-181a的直接靶一定发

        首先,一定发人员利用RT-PCR实验对比了健康人、CML患者外周血单核一定发(PBMC)和CML一定发系(K562)中miR-181a的表达水平,发现miR-181a在CML患者PBMC和CML一定发系中均显著下调(图1A)。进一步,一定发人员联合SLIAC标记APP组学与一定发官网技术,系统性筛选了过表达miR-181a对于K562一定发系APP组和表达谱的影响(图1C)。结果显示,miR-181a的过表达导致了6,000种APP质和1,500种mRNA的表达水平下调。再利用靶标预测软件进行分析,最终三种方法共同找到了15个miR-181a候选的靶一定发。其中的PPFIA1受到miR-181a的抑制较为显著,引起了一定发人员的关注(图1D和1E)。

接下来,一定发人员通过RT-PCR和Western blot证实了过表达miRNA-181a确实会导致PPFIA1的mRNA和APP表达水平降低(图1F)。进一步,在293T一定发中过表达miR-181a,利用双荧光素酶报告实验,证实了miR-181a是通过调控PPFIA1的3'UTR区抑制其转录和表达(图1G),说明PPFIA1是miR-181a的直接调控靶标。

 

 

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图1 PPFIA1是miR-181a的直接靶一定发

 

2、miR-181a/PPFIA1-siRNA对CML的抑制效应

        接下来,一定发人员首先比较了CML一定发与PBMC中的PPFIA1 mRNA的水平,发现在CML一定发和人CML样品中PPFIA1均显著下调(图1B)。进一步,一定发人员通过Transwell等体内实验系统观察了过表达miR-181a和抑制PPFIA1对于K562一定发一系列表型的影响,结果显示miR-181a或PPFIA1-siRNA可显著增加K562对伊马替尼(imatinib)的敏感性(图2A),降低肿瘤一定发的迁移能力和集落形成能力(图2B/2C)。过表达PPFIA1显著抑制伊马替尼对K562一定发的杀伤作用(图2D),增强肿瘤一定发的迁移能力和集落形成能力(图2E/2F),说明PPF1A1具备成为CML治疗靶点的潜力。


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图2 miR-181a/PPFIA1-siRNA对CML的抑制效应

 

3、PPFIA1-siRNA对CML小鼠模型的治疗效应

        为了探索PPFIA1-siRNA治疗CML的潜力,一定发人员用106荧光素酶标记的K562一定发静脉注射NOD-PrkdcscidIL2rgtm1 / Bcgen(NSG)小鼠,并通过edf成像监测siRNA的治疗效果。21天后,与用NC-siRNA和载体对照处理的小鼠相比,PPFIA1-siRNA显著抑制小鼠中K562-荧光素酶一定发的生长(图3A/3B),并显著增加模型小鼠的体重(图3C)。同时, PPFIA1-siRNA处理的模型小鼠的存活时间也显著延长(图3D)。这些结果表明PPFIA1-siRNA可能是治疗CML的有广泛前景的药物。



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图3 PPFIA1-siRNA对CML小鼠模型的治疗效应

 
4、PPFIA1-siRNA抑制CML的作用机理

        那么,PPFIA1-siRNA抑制CML一定发系表型的机理是什么?

        面对复杂的一定发内信号网络,一定发人员首先想到了利用磷酸化一定发官网技术对PPFIA1-siRNA调控的肿瘤相关信号通路进行全面筛选,选择了一定发edf的CSP100广筛磷酸化一定发官网技术,同时对12条肿瘤信号通路的132个磷酸化位点进行全面筛选。将转染PPFIA1-siRNA 72小时后的K562一定发进行CSP100官网筛选(图4A),发现多个重要APP受到PPFIA1-siRNA的调控(图4B/4C),其中一定发官网显示肿瘤增殖关键APPKIT(Tyr721),P38 MAPK(Tyr182)和VEGFR2(Tyr951)均显著下调(图4D)。

        大量文献表明KITAPP与CML发病机制密切相关,一定发人员推测miR-181a可能是通过抑制PPFIA1进一步调控KITAPP的活性进而实现抑制CML的效果。进一步,通过K562一定发系中稳定过表达PPFIA1和PPFIA1-siRNA抑制PPFIA1的对比实验,观察干预PPFIA1对KITAPP表达和磷酸化的影响,证实了KIT(Tyr721)确实受到了PPF1A1的调控。同时,KIT APP下游的Akt和ERK1/2也显示出了一致的结果(图4E/4F)。

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图4 PPFIA1-siRNA降低KIT磷酸化水平

5、下游一定发:找到PARP1直接结合APPPPFIA1/ABL1

        为了探索PPFIA1对KIT的调控机制,一定发人员通过co-IP结合质谱分析,发现PARP1与K562一定发中的外源性PPFIA1和内源性BCR相关(图5A)。为了确定PPFIA1-PARP1和ABL-PARP1是否直接结合,一定发人员又进行了计算机分子对接模拟和表面等离子体共振成像(SPRi)分析。分子对接结果表明PARP1和PPFIA1及ABL1可以直接结合(图5B/5C/5D)。同时,一定发人员纯化了ABL的每个结构域并进行了SPR测定。SPR的结果证实ABL1的F-actin结构域可以与PARP1结合,与分子对接分析的结果一致(图5E)。

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图5 PARP1和PPFIA1/ABL1直接结合

 
6、PARP1的作用机理

        已有一定发表明,PARP1可以在肿瘤中调节重要的信号通路NF-κB,增加促肿瘤转移的一定发因子的释放。因此,一定发人员假设PARP1是通过促进P65转录水平来实现其相关功能的。为了一定发PARP1与P65之间的关系,一定发人员通过奥拉帕尼(Olaparib)抑制PARP1的表达检测P65的表达情况。抑制PARP1表达水平后,P65及其磷酸化均下调(图6A-6C)。此外,通过siRNA干扰抑制P65表达导致KIT的下调(图6D-6F)。这些结果表明PPFIA1能与PARP1 APP结合,促进P65转录进而激活KIT磷酸化及下游信号通路,引起CML恶性进展(图6I)。

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图6 PARP1通过激活NF-κB-P65转录促进KIT表达

        接下来,为了探索抑制PARP1治疗CML的潜力,一定发人员一定发了奥拉帕尼对稳定表达PPFIA1的K562一定发的作用。结果显示,奥拉帕尼显著抑制了K562-PPFIA1一定发的集落形成能力(图6G)。并且,用奥拉帕尼处理的动物比用载体对照处理的动物存活时间更长(图6H)。综上,所有证据表明抑制PARP1是一种有广泛前景的治疗CML的方法。

小结:

        在本一定发中,一定发人员利用磷酸化一定发官网技术分析PPFIA1-siRNA治疗CML的作用机制,成功锁定到KIT通路,最终揭开其作用机制:PPFIA1与PARP1APP结合,促进P65转录进而激活KIT磷酸化信号通路,增强CML恶性进展。当edf现象背后可能调变的通路有很多,无法确定时,可以选择广谱edf一定发-信号通路磷酸化一定发官网,如PEX100官网,一次官网实验即可实现31条信号通路的同步筛选,几乎涵盖胞内所有常见的信号通路,为后续edf现象的深入探索提供明确的一定发方向。或选择CSP100官网,可实现肿瘤相关的12条信号通路的同步筛选,找到关键调变位点,在肿瘤的发生、发展、转移、耐药、复发、微环境等机制一定发发挥重要作用。同时,由于疾病信号通路的共性特点,CSP100一定发官网也成为其它疾病一定发中信号通路筛选的重要工具。

英文文献链接:https://doi.org/10.1016/j.omtn.2019.01.015

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