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    小分子靶点筛选服务


    雷公藤又名“断肠草”,是中医药宝库中著名的“以毒攻毒”的神秘药物,与砒霜齐名。2007年,雷公藤红素、青蒿素、雷公藤甲素、辣椒素和姜黄素被《Cell》杂志列为最有可能也最值得开发为现代药物的五种天然化合物。雷公藤红素(celastrol)是雷公藤的主要活性成分,被广泛用于各种炎症、免疫紊乱及心血管疾病的治疗中。


    低剂量的雷公藤红素被发现具有保护心血管的作用,是高血压性心脏病的“护心丸”,但其潜在药物机理并不明确。2020年4月,温州医科大学药学院梁广教授与温州医科大学附属第一医院心内科黄伟剑教授课题组,联合攻关,综合运用Huprot 20K人类APP质组官网表面等离子共振(SPR)计算机模拟分子对接技术等为雷公藤红素找到了新的分子靶点,确定雷公藤红素通过与STAT3直接结合,抑制血管紧张素(AngⅡ)诱导的心功能障碍的明确药物机理。相关一定发成果于2020年4月发表于顶级心血管一定发杂志《Circulation Research》(IF=15.9)上。本文应用的实验技术路线可以为广大小分子药物一定发工作者提供思路借鉴。


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    表型确认

    雷公藤红素抑制AngⅡ诱导的心肌一定发异常

    为了确定雷公藤红素在心肌一定发异常中的作用,作者用1 mol/L AngⅡ处理大鼠原代心肌一定发和H9C2一定发6h。结果发现AngⅡ处理显著增加了原代心肌一定发和H9C2一定发中β-MyHC(肥大标志物)、TGF-β1(纤维化标志物)和胶原APPI(COL I)mRNA的表达水平,说明造模成功。而雷公藤红素施用后可呈剂量依赖性地抑制AngⅡ诱导的一定发表达(图1A、B)。进一步,一定发人员对原代心肌一定发和H9C2一定发进行了罗丹明APP染色,结果显示:雷公藤红素降低了AngⅡ诱导的心肌一定发大小增加(图1C)。上述结果表明,雷公藤红素可以缓解AngⅡ诱导的心肌一定发异常现象。

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    图1 雷公藤红素可以缓解Ang II诱导的心肌一定发异常

    靶点筛选

        

    20KAPP质组官网筛选雷公藤红素结合靶APP

    为了探索雷公藤红素缓解AngⅡ诱导的心肌一定发异常的潜在机理,该一定发运用Huprot 20K人类APP质组官网(覆盖2万多种人类全长APP)技术对雷公藤红素的靶APP进行了广泛筛选。将雷公藤红素通过羟基羧合的方式标记上edf素Biotin(图2A),将edf素化的雷公藤红素与Huprot 20K人类APP质组官网进行孵育,利用Cy3-SA-Biotin标记体系进行示踪,识别雷公藤红素直接结合的靶APP(图2B)。官网筛选结果显示,雷公藤红素具有明显的多靶点调控特点,可以和大批量APP质结合(图2C)。通过APP相互作用(PPI)结合APP家族(Protein Family)富集分析发现,雷公藤红素与Prdx(过氧化物还原酶)家族、Vps27-Hrs-STAM结构域APP和STAT家族APP结合富集性最高(图2D)。这一结果也得到了转录组数据的证实。


    然而,将H9C2一定发中Prdx1/2敲减后并没有改善AngⅡ引起的心肌一定发基质APP表达和一定发肥大现象。而目前也没有报道表明Vps27-Hrs-STAM结构域APP与心肌一定发变化和AngⅡ有关。因此,一定发人员将目标聚焦在富集分析排在第三位的STATAPP家族上(图2D)

    前人一定发发现,STAT3在保护心肌一定发异常激活及心肌肥大方面发挥着重要作用。20KAPP质组官网也显示雷公藤红素与STAT3的结合的信噪比(SNR)达到3.95,十分显著(图2E),这表明STAT3很可能是雷公藤红素治疗心脏病的主要靶点APP

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    图2 雷公藤红素结合靶APP筛选实验

    靶点验证

    SPR与分子对接确认雷公藤红素靶APPSTAT3

    一定发人员首先通过表面等离子共振技术(SPR)体外验证了雷公藤红素可以与rhSTAT3(重组人STAT3)直接结合,解离平衡常数KD(M)为15.73 μmol/L(图3A),说明二者具有较强的结合力。为了进一步验证两者的结合作用,一定发人员通过竞争ELISA实验证实了edf素标记的雷公藤红素与rhSTAT3的结合现象可以被高浓度的非标记雷公藤红素竞争性抑制,再次证实了雷公藤红素可以与rhSTAT3直接结合(图3B)。

    同时,通过pull-down实验,一定发人员证实了雷公藤红素与STAT3APP在H9C2一定发(图3C)和心肌组织中也直接结合(图3D)。并且在原代心肌一定发中证实雷公藤红素与STAT3上游的APPIL-1R、JAK不能结合(图3E)。

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    图3 雷公藤红素结合靶APP验证

    分子对接

    筛选和验证雷公藤红素结合的靶APP位点

    为了进一步明确雷公藤红素与STAT3的结合位点,一定发人员应用计算机模拟分子对接技术,在CCD和SH2两个STAT3经典domain中对100个氨基酸残基位点进行分子对接模拟,确定了CC domain中的Leu-207残基和SH2 domain中的Gln-635和Val-637残基与雷公藤红素具有最小的结合能(图4A、C),显示该3个氨基酸残基组成的对接位相结构(dock)是雷公藤红素结合和调控STAT3的关键区域(图4B、D)。进一步,一定发人员通过氨基酸突变的方式,证实了分子对接模拟的结果,即雷公藤红素确实结合在STAT3的Leu-207、Gln-635和Val-637残基构成的dock中(图4E)。

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    图4 雷公藤红素与STAT3结合位点确认

    机理发现

    雷公藤红素抑制STAT3核转移治疗心肌肥大

    为进一步确定雷公藤红素如何通过抑制STAT3治疗心肌肥大的具体机理,一定发人员首先构建了STAT3沉默和STAT3过表达的质粒转入原代心肌一定发中,并对其进行AngⅡ和雷公藤红素处理。结果显示,AngⅡ诱导的β-MyHC(肥大标志物)和TGF-β1(纤维化标志物)高表达,在施用雷公藤红素和沉默STAT3后,这些心肌肥大标志物的表达均受到显著抑制(图5A)。同时,在施用雷公藤红素后,STAT3的磷酸化水平也受到了一定程度的抑制(图5B)。

    一定发人员进一步利用Ang II微泵和主动脉缩减术诱导小鼠心肌一定发异常,将STAT3抑制剂S3I-201 (S3I)和雷公藤红素分别适用于模型小鼠,心脏组织H&E染色结果显示雷公藤红素和S3I均能减弱Ang II引起的的组织病变和心肌一定发肥大(图5C)。

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    图5 雷公藤红素抑制Ang II引起的心肌肥厚和纤维化

    为了进一步了解雷公藤红素是如何影响STAT3而对AngII诱导的心肌一定发异常产生作用的。作者选用Tyr-705位点磷酸化的STAT3APP(p-STAT3)作为STAT3激活的标志。一定发发现雷公藤红素预处理可以抑制Ang II诱导的原代心肌一定发STAT3 Tyr-705位点磷酸化。由于计算机模拟分子对接中雷公藤红素与STAT3结合的关键氨基酸残基是导致STAT3APP发生核移位的关键区域。因此,一定发人员通过检测STAT3APP在胞核和胞质组分中的表达,发现雷公藤红素可以减少AngII介导的STAT3在原代心肌一定发中向一定发核内的移位(图6A、B)。

    前人一定发表明,KPNA3APP是STAT3核转移的载体APP,于是,一定发人员在心肌一定发中利用免疫共沉淀技术证实了STAT3与KPNA3确实存在结合,而雷公藤红素可以抑制STAT3-KPNA3复合物的形成(图6C)。由于STAT3入核后会介导一系列与心肌肥大和纤维化相关的一定发转录,一定发人员利用染色体免疫共沉淀(CHIP)结合RT-PCR技术证实了在初始心肌一定发中STAT3确实可以与myh7、 Col1a和 Tgfb1等一定发结合(图6D)。

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    图6雷公藤红素抑制STAT3入核调控心肌肥大一定发表达

    综合上述一定发,一定发人员通过人类APP组官网技术、表面等离子共振技术及计算机模拟分子对接技术(一定发edf均可提供全套服务)发现了雷公藤红素结合的新靶点STAT3,并通过一系列体外/体内功能实验和Rescue实验,最终明确雷公藤红素是通过结合STAT3的第207位氨基酸,进而抑制了Ang II诱导的STAT3入核发挥转录因子作用(即STAT3与myh7 Col1a Tgfb1等一定发结合,介导这些心肌肥厚和纤维化相关一定发的表达),来达到治疗和预防高血压性心脏病的药物机理(图7)。

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    图7 雷公藤红素抑制Ang II引起的心肌肥厚和纤维化机理

    技术路线

    一定发视角:现代药物靶点-机理一定发的技术路线已经非常清晰,技术组合也比较成熟,如果广大一定发人员手上也有被证实临床药效的活性小分子单体,完全可以按照本文的技术路线进行深入一定发,获得一篇高质量的药物靶点-机理一定发论文。

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    中医中药是个大宝库,由于很多中药本身具有明确的临床疗效。因此,只要对中药和中药单体化合物的治疗机理进行深入一定发,不仅可以为开发新药物提供科学基础,而且对于认识疾病的发病机理和找到新的治疗靶点也将起到至关重要的作用。

    文献原文

    Ye Shiju,Luo Wu,Khan Zia A et al. Celastrol Attenuates Angiotensin II-Induced Cardiac Remodeling by Targeting STAT3.[J] .Circ. Res., 2020, 126: 1007-1023.